Апоптоз клеток-мигрантов кожи у детей с атопическим дерматитом на фоне применения крема «Скин-Кап»

Опубликовано в журнале:
«Аллергология» 2006, № 3, С. 7-11

Апоптоз клеток-мигрантов кожи у детей с атопическим дерматитом на фоне применения крема «Скин-Кап»

К.С. Казначеев, Л.Ф. Казначеева, А.В. Молокова
Новосибирский государственный медицинский университет (ректор — чл.-корр. РАМН, акад. РАЕН, проф. А.В. Ефремов)

Ключевые слова: атопический дерматит, апоптоз, кожное окно.

APOPTOSIS OF MIGRANT SKIN CELLS IN CHILDREN WITH ATOPIC DERMATITIS DURING TREATMENT WITH «SKIN-CAP» CREAM

K.S. Kaznacheev, L.F. Kaznacheeva, A.V. Molokova

Key words: atopic dermatitis, apoptosis, «skin window».

The aim of the study: to study the dynamics of migrant skin cells apoptosis upon the influence of «Skin-cap» cream.

Materials and methods. Migrant skin cells of healthy children and children with severe atopic dermatitis (AD) with disease duration from 2 up to 10 years were investigated. The «skin window» method in D.N.Mayanskiy interpretation and subsequent staining with fluorescent marked Annexin-V and propidium iodide was used to identify alive, died and apoptotic cells.

Results. Considerable and significant enhancement of migrant skin cells (predominantly mononuclears) apoptosis was registered after 14 days of therapy with «Skin-cap» cream along with clinical improvement.

Conclusion. Significant loss of active effector cells lead to decrease in inflammation activity and to clinical AD improvement. Apoptotic way of cell death is exactly the way to lessen the impact of intracellular pro-inflammatory mediators on neighbor cells.

В детском возрасте среди аллергических заболеваний первое место занимают аллергические поражения кожи, на долю которых приходится 50–70 %, преобладающей нозологической формой является атопический дерматит (АД). Распространенность АД среди детского населения составляет 10–28 % [1, 5, 7, 10]. В г. Новосибирске распространенность АД среди детей дошкольного возраста составляет 17,4 %, среди школьников — 5,4 %. Особенностью течения АД в настоящее время можно считать инверсию клинических проявлений, связанную с формированием осложненных форм патологии в 25–34 % случаев, присоединением вторичной бактериальной и микотической инфекции. В случае присоединения оппортунистической инфекции течение АД приобретает нетипичные клинические симптомы, рецидивирующее течение и резистентность к базисной терапии.

Среди механизмов развития АД ведущее значение придается иммунным нарушениям [1, 2, 5, 7]. Кроме особенностей системной реакции иммунитета существенное патогенетическое значение имеет оценка состояния иммунокомпетентных структур кожи и обусловленных ими патогистологических изменений в эпидермисе и дерме. Дермальный инфильтрат в острой стадии состоит преимущественно из лимфоцитов с небольшой примесью гистиоцитов (дермальных макрофагов), эозинофильные и нейтрофильные лейкоциты встречаются редко [14, 15]. Данные о состоянии этой клеточной популяции в коже при АД малочисленны. Иммуногистохимические исследования показали, что лимфоциты в дермальном инфильтрате имеют преимущественно фенотип Т-хелперов. Кроме того, большинство Т-клеток экспрессируют высокий уровень кожного лимфоцитарного антигена (CLA), позволяющего участвовать в формировании локальных кожных реакций.

После принятия концепции апоптоза гибель лимфоцитов под влиянием определенных дозировок глюкокортикостероидов (ГКС) стала рассматриваться как классическая модель апоптоза [17].

Известно, что специфические рецепторы к ГКС имеются у большинства клеток. Чувствительность клеток к ГКС зависит от стадии их развития. Пре-Т-клетки костного мозга и незрелые клетки тимуса исключительно чувствительны к физиологическим дозам ГКС. Совсем недавно появились данные о чувствительности к высоким дозам ГКС определенных субпопуляций периферических лимфоцитов, в частности цитотоксических Т-лимфоцитов и NK [4, 16].

Топические ГКС — препараты выбора для лечения больных неосложненными формами АД, поскольку обладают выраженной противовоспалительной активностью, действуя на все стадии аллергического воспаления [4, 7, 11, 13]. В последнее время спектр противовоспалительных топических средств расширен в связи с появлением ингибиторов кальциневрина (пимекролимус, такролимус), механизм действия которых основан на селективном ингибировании Т-клеток. Однако высокая частота контаминации кожи больного ребенка микроорганизмами, грибами создает дополнительные трудности адекватного наружного лечения [3, 8]. При осложненных формах АД приоритетные топические препараты (ГКС, ингибиторы кальциневрина) противопоказаны.

Выход из сложившейся ситуации предлагают разработчики препарата «Скин-Кап» (Хеминова Интернасьональ, С.А., Испания). Действующим началом «Скин-Кап» является активированный цинк пиритион (АЦП). АЦП оказывает противовоспалительное, а также ингибирующее действие на клетки кожи, находящиеся в стадии гиперпролиферации, и не производит подобного действия на нормально делящиеся клетки. Имеются данные о регулирующем действии препарата на апоптотические процессы в коже. В клеточном цитозоле АЦП ингибирует внутриклеточный уровень АТФ, способствует деполяризации мембран клеток, вызывая гибель грибов, бактерий, а также вовлеченных в патологический процесс клеток, особенно находящихся в процессе пролиферации. При этом в терапевтических концентрациях препараты, содержащие АЦП, не оказывают подавляющего действия на нормально функционирующие клетки.

В исследовании А.В. Самцова и соавт. [9] были изучены иммуногистологические изменения кожи больных АД до и после наружной терапии препаратом «Скин-Кап», и проведено сравнение их с иммуногистологическими изменениями кожи до и после наружной терапии кремом, содержащим метилпреднизолона ацепонат [9]. После сравнительного анализа было выявлено, что у больных, получавших терапию кремом «Скин-Кап», наблюдалась выраженная нормализация некоторых патологических симптомов в эпидермисе и дерме, в частности: уменьшение гиперкератоза с появлением сетчатого рогового слоя, полное исчезновение паракератоза, а также уменьшение степени акантоза эпидермиса, что, возможно, объясняется антипролиферативным действием АЦП. Анализ количественного состава дермального инфильтрата показал, что у больных первой группы после лечения гистиоциты стали преобладать в клеточном инфильтрате (соотношение Т-лимфоцитов и гистиоцитов 1:2), тогда как у больных второй группы количество гистиоцитов и Т-лимфоцитов оказалось практически одинаковым. Учитывая, что дермальные макрофаги выполняют в коже ряд важнейших функций, повышение их количества у больных первой группы после лечения можно отнести к положительным эффектам крема «Скин-Кап».

В работах канадских авторов [12, 18] показано значительное усиление апоптоза клеток кожи при псориазе через 48 ч от применения препарата. Классические гистологические признаки псориаза были устранены за две недели. Была выдвинута гипотеза о предположительном блокировании действия цитокинов и факторов роста, за счет чего возникает апоптоз кератиноцитов. При обсуждении отличий механизма действия препарата «Скин-Кап» и стероидов авторы не отмечали появления значительного количества апоптотических клеток на протяжении двухнедельного применения топических стероидов, в связи с чем можно предположить, что при использовании ГКС усиление апоптоза не является ключевым механизмом рассасывания бляшек.

Из вышеперечисленного становится очевидным, что необходимо дополнительное исследование проапоптотической активности АЦП на клетки-эффекторы аллергического воспаления в коже. Одним из наиболее легко выполнимых способов мобилизации клеток-эффекторов является метод «кожного окна». Показано, что при исследовании клеточного состава мигрантов «кожного окна» на разных стадиях лечения АД безусловным признаком улучшения процесса является так называемая «смена фаз», т. е. замена вида преобладающих клеток, что совпадает с динамикой изменений в биоптатах кожи. Предполагается, что повышение апоптотической активности лимфоцитов под действием лекарственных средств является основным механизмом «смены фаз».

Материалы и методы

Обследовано 35 детей в возрасте от 5 до 17 лет (17 мальчиков и 18 девочек) с АД, в наружной терапии которых использовали крем «Скин-Кап». У всех больных отмечалось тяжелое, упорно рецидивирующее течение заболевания, у 8 человек диагностирована диффузная форма, осложненная вторичным инфицированием. Стаж заболевания составлял от 2 до 10 лет. На момент исследования дети не получали терапию топическими стероидами. Длительность использования крема «Скин-Кап» составила 14 дней, крем наносили на пораженные участки. Контрольную группу составили 19 детей того же возраста без аллергических заболеваний в анамнезе, не получавших медикаментозную терапию и не применявших средств по уходу за кожей.

Дополнительно были обследованы 15 детей по следующим методикам:

1. Метод «кожного окна» по Reabuck в модификации Д.Н. Маянского [6] — исследование клеточного состава мигрантов «кожного окна» на разных стадиях заболевания и терапии.
   В средней трети ладонной поверхности предплечья удаляют верхний слой эпидермиса (не затрагивая более глубокие слои кожи), создавая «окно» диаметром 0,1 см. К «кожному окну» фиксируют предметное стекло, через 4 ч заменяя новым, которое снимают через 20 ч. На препаратах подсчитывают общее число и состав мигрировавших клеток.
2. Оценка спонтанного и индуцированного апоптоза клеток-мигрантов кожного окна с использованием специальных окрасок (Annexin V-PE, пропидия иодид) в флуоресцентном микроскопе.

Используемый Annexin V специфически связывается с мигрировавшими на поверхностный листок в ходе апоптоза молекулами фосфатилдисерина внутреннего листка клеточной мембраны, маркируя таким образом начальную стадию апоптотической клеточной гибели. На поздних этапах клеточной гибели происходит увеличение проницаемости клеточной мембраны, вследствие чего красители, тропные к ДНК (пропидия иодид), могут проникнуть в клетку. Одновременное использование двух красителей позволяет выделить в клеточной популяции три класса клеток: неокрашенные — живые, окрашенные только Annexin V — погибающие по апоптотическому пути, но еще не утратившие целостность клеточной мембраны, и клетки, окрашенные как Annexin V, так и пропидием иодидом — погибшие клетки, безотносительно некротического или апоптотического вида клеточной смерти. В ходе определения в каждом препарате подсчитывалось 500 клеток, с последующей идентификацией их вида.

Статистическая компьютерная обработка полученного материала проведена в программах Statistica Pro 9.0, Biostat. Проводился сравнительный анализ по критериям χ² и Стьюдента в модификации для малых групп.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследовали возможное влияние проведения «кожного окна» на процессы клеточной гибели. При исследовании здоровых детей было выявлено, что наложение «кожного окна» вызывает увеличение доли как апоптотических, так и погибших клеток-мигрантов, с преобладанием последних (сравнивались препараты 4 и 24 ч). В препаратах среди апоптотических клеток преобладали полинуклеарные лейкоциты. Среднее количество погибших клеток не превышало 7,5 % (табл. 1).

Таблица 1.
Доля апоптотических и погибших клеток-мигрантов «кожного окна» у здоровых детей (M±m,%)

Динамика изменений доли апоптотических и погибших мононуклеаров у детей с АД до начала терапии кремом «Скин-Кап» слабо отличалась от изменений, выявленных в контрольной группе (p1–4, p2–4 > 0,05, где в записи первая цифра 1–4 — номер сравниваемой группы, вторая цифра — время сравнения). Уровень клеточной гибели через 4 ч не отличался от контрольной группы, при анализе препаратов 24 ч было выявлено достоверное увеличение как апоптотических, так и погибших клеток, с преобладанием прироста апоптотических мононуклеаров (p1–24 < 0,001; p2–24, p3–24, p4–24 < 0,01, где в записи 1–4 первая цифра — номер сравниваемой группы, вторая цифра — время сравнения) (табл. 2).

Таблица 2.
Доля апоптотических и погибших клеток-мигрантов «кожного окна» у детей с АД до начала терапии кремом «Скин-Кап» (M±m,%)

Таким образом, очевидно, что повреждающее действие АД значительно усиливает процессы клеточной гибели клеток-мигрантов по сравнению с действием «кожного окна» на здоровой коже.

На фоне терапии кремом «Скин-Кап» отмечали значительное снижение интенсивности воспаления (индекс SCORAD исходно — 51,36 ± 6,86 балла, после терапии — 22,42 ± 6,15 балла, p < 0,01), сокращение площади поражения кожи (31,23 ± 11,49 % против 20,15 ± 8,66), а в 8 случаях — наступление полной клинической ремиссии.

При анализе изменений клеточной гибели после применения крема «Скин-Кап» были получены следующие результаты (табл. 3).

Таблица 3.
Доля апоптотических и погибших клеток-мигрантов «кожного окна» у детей, страдающих АД после терапии кремом «Скин-Кап» (M±m,%)

Уровень клеточной гибели через 4 ч достоверно и значительно превышал как результаты, полученные у здоровых детей, так и у детей с АД (p < 0,001). Но прирост доли и погибших, и апоптотических клеток через 24 ч был относительно ниже, чем до начала терапии. При анализе клеточного состава было выявлено достоверное преобладание через 4 ч апоптотических мононуклеаров (по сравнению как с контрольной группой, так и с результатами до начала терапии, p < 0,01), а в препаратах через 24 ч отмечалось равное содержание апоптотических моно- и полинуклеаров.

На основании полученных данных можно сделать предположение о том, что препарат «Скин-Кап» оказывает проапоптотическое действие на клетки-мигранты кожи, непосредственно участвующие в развитии аллергического воспаления. Тем самым достигается значительное сокращение количества активных клеток-эффекторов, что приводит к снижению уровня воспаления и улучшению клинических проявлений. Кроме того, поскольку гибель клеток-эффекторов происходит по апоптотическому пути, не наблюдается дополнительного выброса медиаторов воспаления из погибших клеток.

ЛИТЕРАТУРА
1. Аллергические болезни у детей: Руководство для врачей / Под ред. М.Я. Студеникина, И.И. Балаболкина. — М.: Медицина, 1998. — 123 с.
2. Балаболкин И.И., Гребенюк В.Н. Атопический дерматит у детей. — М.: Медицина, 1999. — 240 с.
3. Казначеева Л.Ф., Денисов М.Ю., Молокова А.В. и др. Современные технологии реабилитации детей с аллергодерматозами. — Новосибирск, 2000. — 196 с.
4. Кунгуров Н.В., Герасимова Н.М., Кохан М.М. Атопический дерматит. Типы течения, принципы терапии. — Екатеринбург, 2000. — 272 с.
5. Ильина Н.И. Эпидемия аллергии — в чем причины? // Росс. аллерг. журнал. — 2004. — № 1. — С. 37–41.
6. Маянский Д.Н., Урсов И.Г. Лекции по клинической патологии. — Новосибирск: СОРАН, 1997. — 250 с.
7. Ревякина В.А. Аллергические болезни у детей в Российской Федерации // В сб. тезисов II Всеросс. конгресса по детской аллергологии. — М., 2003. — С. 170.
8. Ревякина В.А., Бондаренко Е.В., Аджимамудова И.В. Эффективность реабилитации детей с аллергическими заболеваниями // Педиатрия. — 2001. — № 5. — С. 87–92.
9. Самцов А.В., Латий, О.В., Белоусова И.Э. Иммуногистологические особенности применения препарата скин-кап в сравнении с наружными стероидами у больных атопическим дерматитом // Vestn. Dermatol. Venerol. — 2005.
10. Торопова Н.П., Синявская О.А. Экзема и нейродермит у детей. — Екатеринбург, 1993. — 447 с.
11. European Allergy White Paper. Allergic diseases as a public problem in Europe. — The UCB Institute of Allergy, 1997. — 118 p.
12. Dinning, AL-Adham, Austinet al. Pyrithione biocide interactions with bacterial phos-pholipid head groups // J. Appl. Microbiol. — 1998. — Vol. 85, № 1. — P. 132–140.
13. Hanifin J.M., Rajka G. Diagnostic features of atopic dermatitis // Acta Derm. Venerol. — 1980. — Vol. 92. — P. 44–47.
14. Hofer M.F. Atopic dermatitis: the first allergic step in children // Rev. Med. Suisse Romande. — 2000. — Vol. 120, № 3. — P. 263–267. Kang K., Stevens
15. S.R. Pathophysiology of atopic dermatitis // Clin. Dermatol. — 2003. — Vol. 21, № 2. — P. 116–121.
16. Leung D. Pathogenesis of atopic dermatitis // J. Allergy Clin. Immunol. — 1999. — Vol. 104. — P. 99–108.
17. Majino G., Joris I. Apoptosis, oncosis and necrosis. An overview of cell death // Amer. J. Pathol. — 1995. — Vol. 146, № 1. — P. 3–15.
18. Rowlands C.G., Dandy F.W. Histopathology of psoriasis treated with zinc pyrithione // Am. J. Dermatopathool. — 2000. — Vol. 22. — P. 272–276.

www.medicusamicus.com

medi.ru